項(xiàng)目名稱(chēng)： 生物大分子光散射分析的方法與理論研究

推薦單位： 教育部

項(xiàng)目簡(jiǎn)介： 在分子光譜分析法中，散射光始終是一個(gè)干擾信號(hào)。本研究利用這種干擾信號(hào)建立了光散射光譜分析方法，形成分子光譜分析的一個(gè)新分支。生物大分子（核酸、蛋白質(zhì)、糖類(lèi)等）的分析測(cè)定是生命科學(xué)領(lǐng)域的重要研究課題，光散射光譜分析法大大提高了檢測(cè)的靈敏度和選擇性。

本研究(1)發(fā)現(xiàn)某些有機(jī)小分子與生物大分子反應(yīng)使生物大分子的光散射大大增強(qiáng)，并且光散射的增強(qiáng)程度與生物大分子的量成正比，據(jù)此建立了生物活性物質(zhì)的共振光散射光譜分析法；(2)發(fā)現(xiàn)了用普通熒光光度計(jì)即可測(cè)定這種光散射增強(qiáng)信號(hào)，并建立了一系列操作簡(jiǎn)便、靈敏度高的核酸、蛋白質(zhì)等生物大分子定量分析新方法, 進(jìn)一步推廣到糖類(lèi)和其他生物活性物質(zhì)的分析測(cè)試；(3)確定了光散射分析的定量基礎(chǔ)，提出了光散射強(qiáng)度與物質(zhì)的量成線(xiàn)性關(guān)系的表達(dá)函數(shù)；(4)建立了界面全內(nèi)反射光散射分析法、后向光散射分析法和光散射成像等系列光散射分析法, 實(shí)現(xiàn)了復(fù)雜樣品（如血液）的直接分析；(5)發(fā)現(xiàn)了發(fā)光強(qiáng)度與有機(jī)小分子(染料、藥物等)和生物大分子的荷電性質(zhì)、靜電結(jié)合程度、所形成復(fù)合物的大小、形狀和數(shù)量等信息有關(guān)，為設(shè)計(jì)新型分子探針并研究其與生物大分子的作用機(jī)理提供理論指導(dǎo)。

在A(yíng)nal Chem等SCI收錄刊物上發(fā)表論文112篇, 被SCI收錄的刊物上他引1821次。10篇代表性論文他引597次。其中1996和1997年發(fā)表在A(yíng)nal Chem上的2篇論文的他引次數(shù)分別為201和136，在《1994-2004年十年中國(guó)的化學(xué)高引用論文》中排名第5和第14位（附件4-5-01）。日本分析化學(xué)家藤田芳一把該項(xiàng)工作作為研究熱點(diǎn)介紹給日本同行（ぶんせき<, 1999, (1) 79<）（附件4-5-02）。分析化學(xué)<家胡之德<教授等稱(chēng)"黃等人首先應(yīng)用光散射技術(shù)進(jìn)行分析測(cè)定, 光散射光譜已逐漸成為分析化學(xué)中進(jìn)行核酸和蛋白質(zhì)測(cè)定的有用技術(shù)(Anal. Chim. Acta, 2001, 442, 249)"。美國(guó)著名分析化學(xué)家Marcus教授指出：方法快速、一步的簡(jiǎn)單操作和允許大部分常見(jiàn)干擾如緩沖液成分存在（Anal Chem, 2003, 75, 4801）。<<

主要發(fā)現(xiàn)點(diǎn)： 1、核心發(fā)現(xiàn)點(diǎn)：

發(fā)現(xiàn)某些有機(jī)小分子與生物大分子反應(yīng)使得生物大分子的光散射大大增強(qiáng)，并且光散射的增強(qiáng)程度與生物大分子的量成正比。為此，將分子光譜法中起干擾作用的散射光信號(hào)利用起來(lái)，建立了生物活性物質(zhì)的共振光散射光譜分析法--分子光譜分析學(xué)科(代碼: 1502515)

發(fā)現(xiàn)了用普通熒光光度計(jì)即可測(cè)定有機(jī)小分子與生物大分子作用產(chǎn)生的光散射增強(qiáng)信號(hào)，建立了操作簡(jiǎn)單、靈敏度高的核酸、蛋白質(zhì)等生物大分子的定量分析新方法（代表論文1－5, 8）, 并進(jìn)一步推廣到糖類(lèi)和其他生物活性物質(zhì)（如藥物）的分析測(cè)試（代表論文10）。

2、其他重要發(fā)現(xiàn)點(diǎn)

（1） 通過(guò)建立新的光路系統(tǒng)，改進(jìn)測(cè)量方法，建立了系列光散射新分析方法--分子光譜分析學(xué)科(代碼: 1502515)

全內(nèi)反射光散射分析法：引進(jìn)自我設(shè)計(jì)的液-液界面全內(nèi)反射系統(tǒng)(專(zhuān)利1), 將分析物萃取到液-液界面上, 提高了方法的選擇性。靈敏度比直接光散射分析方法提高1000倍(代表論文6，Anal Chem，2001)，應(yīng)用于實(shí)際血清樣品中的白蛋白分析, 不需預(yù)分離。

后向光散射光譜分析法：引進(jìn)角度調(diào)節(jié)裝置和鏡面反射系統(tǒng)(專(zhuān)利2), 檢測(cè)不同角度的散射光, 結(jié)合液-液界面光反射建立了后向光散射光譜分析法，靈敏度可達(dá)到pg/mL級(jí)（代表論文9，Analyst，2005）。

光散射成像分析方法：使用激光激發(fā), 利用CCD收集單個(gè)散射粒子的發(fā)光信號(hào), 實(shí)現(xiàn)了單個(gè)粒子的散射表征, 建立了基于單個(gè)散射粒子的光散射成像分析方法。檢測(cè)限達(dá)到pg/mL級(jí), 靈敏度比普通的共振光散射分析法和熒光分析法提高1000倍（代表論文7, Anal Biochem，2003）。

（2） 確定了光散射強(qiáng)度與物質(zhì)的量成線(xiàn)性關(guān)系的表達(dá)函數(shù)--分子光譜分析學(xué)科(代碼: 1502515)

確定使用熒光光度計(jì)測(cè)定的光散射信號(hào)強(qiáng)度可用函數(shù)I＝kcdE2( )表示,。這是光散射分析的定量基礎(chǔ)（代表論文2, Anal Chem，1997）。

發(fā)光強(qiáng)度強(qiáng)烈地依賴(lài)于有機(jī)小分子和生物大分子的荷電性質(zhì)、靜電結(jié)合強(qiáng)度、所形成復(fù)合物的大小和數(shù)量。如有機(jī)小分子與蛋白質(zhì)作用，信號(hào)增強(qiáng)可用 I = P + ( 113.9 + 1.78 × 10?3MW) c表示。式中 P包含了蛋白質(zhì)的荷電性質(zhì)及其與有機(jī)小分子靜電作用的強(qiáng)度; MW體現(xiàn)蛋白質(zhì)分子的大小; c為濃度。

主要完成人： 李克安

共同策劃了光散射方法的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及測(cè)定方法的研究課題；進(jìn)行了光散射法對(duì)染料、藥物等小分子物質(zhì)與蛋白質(zhì)、核酸以及糖類(lèi)物質(zhì)等生物大分子反應(yīng)的研究，論證了這些反應(yīng)使得生物大分子的光散射增強(qiáng)程度與生物大分子的量均服從線(xiàn)性關(guān)系，建立了一系列光散射測(cè)定方法（核心發(fā)現(xiàn)點(diǎn)1）。其中糖的測(cè)定對(duì)食管癌的診斷有實(shí)際意義，2005年獲河北省科技進(jìn)步二等獎(jiǎng)。

本人主持的 "生物大分子的散射光譜分析的基礎(chǔ)與應(yīng)用研究"被國(guó)家自然科學(xué)基金委立項(xiàng)支持; 本人負(fù)責(zé)的"光散射技術(shù)用于生物大分子反應(yīng)的基礎(chǔ)與分析應(yīng)用的研究"獲教育部提名國(guó)家科學(xué)技術(shù)獎(jiǎng)的自然科學(xué)一等獎(jiǎng)（2003年）。

本人在該項(xiàng)研究中的工作量占本人工作量的50％。

黃承志

在北京大學(xué)攻讀博士學(xué)位期間在導(dǎo)師童沈陽(yáng)教授和李克安教授的指導(dǎo)下開(kāi)始光散射分析研究, 發(fā)現(xiàn)小分子在生物大分子表面組裝使產(chǎn)生光散射增強(qiáng)現(xiàn)象, 建立了光散射增強(qiáng)與生物活性物質(zhì)的量成正比的定量模型（核心發(fā)現(xiàn)點(diǎn)1）；建立了液-液界面全內(nèi)反射光散射分析法、后向光散射分析法和光散射成像分析法等系列光散射分析法（發(fā)現(xiàn)點(diǎn)2（1））。

對(duì)小分子與生物大分子反應(yīng)產(chǎn)生光散射增強(qiáng)的原理以及光散射法提供散射粒子的形狀，大小和狀態(tài)等信息進(jìn)行了研究，建立了理論模型（發(fā)現(xiàn)點(diǎn)2（2））。對(duì)研究生物大分子的行為提供了一種手段。

本人在該項(xiàng)研究中的工作量占本人工作量的80％。

趙鳳林

研究了光散射信號(hào)增強(qiáng)的必要條件。只有那些可以生成聚集狀態(tài)、聚合粒子非常大且具有較大的摩爾吸光系數(shù)的體系才能導(dǎo)致光散射信號(hào)增強(qiáng)；光散射強(qiáng)度與單個(gè)生色團(tuán)的電性質(zhì)、生色團(tuán)間的電耦合程度以及由此形成的聚集體的大小密切相關(guān)。對(duì)于以靜電作用為主的分子識(shí)別，通常是正電荷試劑與核酸作用，這源于核酸的磷酸根帶負(fù)電荷；而負(fù)電荷試劑通常與蛋白質(zhì)作用，主要是在低于蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的酸度下蛋白質(zhì)帶正電荷。環(huán)境條件如溫度、酸度和離子強(qiáng)度影響它們的靜電結(jié)合能力（發(fā)現(xiàn)點(diǎn)2（2）。建立糖類(lèi)物質(zhì)的光散射分析法（核心發(fā)現(xiàn)點(diǎn)1）。

本人在該項(xiàng)研究中的工作量占本人工作量的50％。

李原芳

用光散射技術(shù)研究了蛋白質(zhì)、核酸等生物大分子與具有抗菌活性的生物染料在體外的相互作用機(jī)理，指出有機(jī)小分子與生物大分子作用產(chǎn)生的光散射增強(qiáng)與生物大分子的分子量有關(guān)，并從分子構(gòu)效的角度探討了有機(jī)藥物分子與蛋白質(zhì)和核酸分子識(shí)別的專(zhuān)一性特征，對(duì)新藥的體外篩選具有指導(dǎo)作用（發(fā)現(xiàn)點(diǎn)2（2））。通過(guò)建立新的光路系統(tǒng),改進(jìn)測(cè)量方法，建立了系列光散射新分析方法（發(fā)現(xiàn)點(diǎn)2（1））。

本人在該項(xiàng)研究中的工作量占本人工作量的60％。

童沈陽(yáng)

作為課題組負(fù)責(zé)人和研究生導(dǎo)師，帶領(lǐng)本課題組于1995年發(fā)現(xiàn)，當(dāng)具有抗菌特性的陽(yáng)離子卟啉在核酸上聚合組裝時(shí)，通過(guò)熒光分光光度計(jì)測(cè)定到卟啉共振光散射信號(hào)被微量核酸大分子大大增強(qiáng)，且增強(qiáng)的光散射信號(hào)與核酸的濃度之間存在線(xiàn)性關(guān)系（核心發(fā)現(xiàn)點(diǎn)1）。在本課題的思路和實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)上提出了指導(dǎo)性意見(jiàn)，并積極推進(jìn)光散射技術(shù)的應(yīng)用研究。與本課題組同志一起，為探討蛋白質(zhì)、核酸等生物大分子與小分子探針的作用機(jī)理提供了一個(gè)檢測(cè)和表征的重要手段。

本人在該項(xiàng)研究中的工作量占本人工作量的50％。