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項目名稱:    乙肝表面抗原-抗體復(fù)合物消除免疫耐受的應(yīng)用基礎(chǔ)研究

推薦單位:    教育部

項目簡介:    本項目屬基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。

幼齡感染乙肝病毒所致的免疫耐受是學(xué)者面臨的重要難題,誘生有效針對乙肝病毒的機體免疫應(yīng)答是消除耐受的關(guān)鍵,但因缺乏系統(tǒng)的應(yīng)用基礎(chǔ)性研究,尚未取得突破性進(jìn)展。在鴨乙肝動物模型中首次發(fā)現(xiàn)病毒抗原-抗體復(fù)合物可消除免疫耐受的基礎(chǔ)上,本項目對乙肝病毒表面抗原(HBsAg)-抗體 (anti-HBs)復(fù)合物(IC)經(jīng)抗原呈遞細(xì)胞(APC)作用后的機制與效應(yīng)提出設(shè)想,系統(tǒng)研究消除免疫耐受的機理,并在臨床研究中予以驗證。

(1)用體外共孵育方法,發(fā)現(xiàn)IC提高了APC攝取及呈遞HBsAg的功能,特異地激活T細(xì)胞,促進(jìn)產(chǎn)生Th1類細(xì)胞因子。在HBsAg陽性轉(zhuǎn)基因鼠中用復(fù)合物免疫,可增強特異性殺傷性T細(xì)胞的作用,增加Th1類細(xì)胞因子的分泌,誘生抗-HBs。發(fā)現(xiàn)復(fù)合物中抗HBs 的Fc段是介導(dǎo)上述作用的關(guān)鍵;用蛋白酶去除抗HBs Fc段,或換用異種動物抗體,則作用顯著降低。

(2)鑒于IC是通過外源性抗原呈遞途徑誘導(dǎo)特異性免疫應(yīng)答,在此基礎(chǔ)上,創(chuàng)新性地設(shè)計經(jīng)外源、內(nèi)源性兩種途徑呈遞HBsAg的方法,將帶有編碼乙肝表面抗原基因的質(zhì)粒DNA加入復(fù)合物組成IC-HBS質(zhì)粒DNA三重復(fù)合物,在HBsAg陽性轉(zhuǎn)基因鼠中可降低肝細(xì)胞內(nèi)HBsAg。獲我國、歐、美授權(quán)發(fā)明專利。發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒DNA 中CpG有利于局部誘生Th1細(xì)胞因子;機械注射在小鼠皮膚內(nèi)可通過Toll-樣受體-9介導(dǎo)釋放細(xì)胞因子。

(3)借助APC表面標(biāo)記檢測及T細(xì)胞激活試驗,在乙肝患者中證實APC與T細(xì)胞間相互作用低下。用復(fù)合物免疫正常人,可誘生高效價抗體及Th1細(xì)胞因子;用復(fù)合物免疫患者,患者的Th1類細(xì)胞因子表達(dá)升高,且血清中出現(xiàn)HBeAg抗體及病毒滴度下降,驗證了動物實驗所揭示的機制。本研究為有效治療乙肝患者奠定了理論基礎(chǔ)。

10篇主要論文被Lancet Infectious Diseases, Nature Review Microbiology,Nature Biotechnology , Hepatology 等引用101次。

主要發(fā)現(xiàn)點:  1.發(fā)現(xiàn)乙肝病毒表面抗原(HBsAg)與高親和力抗體(抗-HBs)組建的抗原-抗體免疫原性復(fù)合物 (Immuogenic complex,IC)與傳統(tǒng)認(rèn)為引起III型變態(tài)反應(yīng)的抗原-抗體免疫復(fù)合物有本質(zhì)不同的作用。IC通過其中抗體Fc段的介導(dǎo),經(jīng)抗原呈遞細(xì)胞表面的Fc受體,將IC中的HBsAg被動地帶入抗原呈遞細(xì)胞內(nèi),使原來因免疫耐受而不能識別HBsAg的抗原呈遞細(xì)胞增強攝取HBsAg。經(jīng)過加工的HBsAg呈遞給T細(xì)胞,激活的T細(xì)胞可誘生T殺傷性細(xì)胞,產(chǎn)生細(xì)胞因子及體液免疫應(yīng)答。而引起III型變態(tài)反應(yīng)的抗原-抗體復(fù)合物或因抗原-抗體比例不當(dāng),或因抗體親和力低下,在血循環(huán)中長期、大量存在,沉積在小血管內(nèi)壁,引起疾病。(屬醫(yī)學(xué)微生物學(xué)科及免疫學(xué)科。代表性論文 1,2,4及中國發(fā)明專利 ZL93112409).

2.發(fā)現(xiàn)在HBsAg-抗-HBs復(fù)合物中加入重組編碼S基因質(zhì)粒DNA 組建-三重復(fù)合物,可更有效地消除對乙肝病毒抗原的免疫耐受。HBsAg-抗-HBs復(fù)合物是通過細(xì)胞攝入而加工、呈遞,屬外源性抗原呈遞過程;質(zhì)粒S-DNA則通過細(xì)胞內(nèi)表達(dá)HBsAg抗原,經(jīng)內(nèi)源性抗原加工呈遞過程。推測如HBsAg經(jīng)外源性及內(nèi)源性兩種不同途徑進(jìn)行抗原呈遞,可更有效地誘生特異性免疫應(yīng)答。在HBsAg陽性轉(zhuǎn)基因鼠中,用三重復(fù)合物免疫,更有效地激活T殺傷細(xì)胞,激發(fā)Th1類細(xì)胞因子,顯著降低肝內(nèi)HBsAg。此外,還發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒DNA中的CpG核苷酸序列可在局部形成有利于TLR9陽性細(xì)胞歸巢,促進(jìn)淋巴結(jié)細(xì)胞表達(dá)IL-12 mRNA,提供Th1型免疫反應(yīng)的微環(huán)境。(屬醫(yī)學(xué)微生物學(xué)科,及免疫學(xué)科。代表性論文 4,7,8,9,10。獲中、美、歐洲發(fā)明專利授權(quán),專利號分別為ZL971062919,6221664B1, 0913157)

3.發(fā)現(xiàn)在慢性乙肝患者中HBsAg-抗-HBs復(fù)合物有消除免疫耐受的作用。慢性乙肝患者中,抗原呈遞細(xì)胞-T細(xì)胞間相互作用功能低下。慢性乙肝患者樹突狀細(xì)胞經(jīng)與復(fù)合物孵育后,CD80,CD86,CD40,HLA-II 標(biāo)記表達(dá)上調(diào),IL-12分泌水平也提高。慢性乙肝患者注射HBsAg-抗-HBs復(fù)合物后,Th1 類細(xì)胞因子升高,HBeAg轉(zhuǎn)陰,出現(xiàn)e抗體,血清病毒DNA降低。此外,正常人用復(fù)合物免疫后可產(chǎn)生高效價抗-HBs 及Th1類細(xì)胞因子。(屬醫(yī)學(xué)微生物學(xué)科、及傳染病學(xué)科。代表性論文3,5,6)

主要完成人:  1.   聞玉梅

提出免疫耐受及消除免疫耐受的設(shè)想。對本項目提出整體思路及設(shè)計,提出階段性研究課題。設(shè)計鴨乙肝,鼠、轉(zhuǎn)基因鼠以及乙肝患者的全部實驗。參加鴨乙肝動物實驗及部分小鼠實驗。參加IC的具體配比及三重復(fù)合物的實驗研究及部分動物實驗,指導(dǎo)研究生及研究人員進(jìn)行實驗,對實驗結(jié)果分析與總結(jié),撰寫論文(論文1-5,論文9-10),對第一、二及三點均有創(chuàng)造性貢獻(xiàn),在該項研究中的工作量占本人工作量的60%。

2.   袁正宏

1.組建了擁有自主知識產(chǎn)權(quán)的帶有編碼HBsAg的基因重組質(zhì)粒DNA(發(fā)明專利號:ZL01105250);

2.發(fā)現(xiàn)了皮膚中TLR9的表達(dá)可受應(yīng)急和外傷等誘導(dǎo),識別CpG后可快速產(chǎn)生細(xì)胞因子,部分揭示了皮膚先天免疫的機制,以此為基礎(chǔ)建立了物理損傷和CpG DNA作為佐劑的增強疫苗接種免疫效果的新策略。

3.參與實施了乙克治療性疫苗的部分臨床實驗,為開展臨床實驗的研究打下了

良好基礎(chǔ)。

論文為6-10,對第二及三點有創(chuàng)造性貢獻(xiàn),在該項研究中的工作量占本人工作量的60%。

3.   瞿滌

負(fù)責(zé)該項目鴨乙肝病毒分離及抗原抗體血清學(xué)研究方法的建立,參加小鼠抗原-抗體-DNA的實驗及設(shè)計,乙肝患者DC細(xì)胞免疫功能的研究,論文為2,4,5,10,對第二及三點有創(chuàng)造性貢獻(xiàn),在該項研究中的工作量占本人工作量的55%。

4.   姚忻

參加治療性乙肝疫苗抗原抗體配比實驗,參加轉(zhuǎn)基因鼠的實驗以及其他的動物實驗。乙克臨床研究病人血淋巴細(xì)胞及樹突狀細(xì)胞的功能研究實驗。具體進(jìn)行流式細(xì)胞CBA實驗檢測病人各階段血清和外周血淋巴細(xì)胞特異性TH1/TH2細(xì)胞因子表達(dá)情況。論文為4,對第二及三點有創(chuàng)造性貢獻(xiàn),在該項研究中的工作量占本人工作量的70%。

5.   何麗芳

參加該項目全過程。具體指導(dǎo)并參與有關(guān)組建抗原-抗體復(fù)合物的實驗研究及部分動物實驗。

參加轉(zhuǎn)基因鼠的實驗工作,參加整理與分析實驗結(jié)果。

論文為4與10,對第一及二點有創(chuàng)造性貢獻(xiàn),在該項研究中的工作量占本人工作量的50%。

10篇代表性論文:  1.   Enhanced immunogenicity in mice with Hepatitis B vaccine complexed to human hepatitis B immunoglobulin. Chinese Medical Journal.1994:107 (10): 741-744

2.   Antigen-antibody complex as therapeutic vaccine for viral hepatitis B. Inter Rev Immunol 1999; 15:251-258.

3.   Hepatitis B vaccine and anti-HBs complex as approach for vaccine therapy. The Lancet 1995; 345: 1575-1576

4.   Therapeutic efficacy of hepatitis B surface antigen-antibodies-recombinant DNA composite HBsAg transgenic mice. Vaccine 2001: 19:4219-4225.

5.   Selective functional deficit in dendritic cell-T cell interaction is a crucial mechanism in chronic hepatitis B virus infection. J Viral Hepatitis 2004; 11:217-224.

6.   Toll-like receptor-9 induced by physical trauma mediates release of cytokines following exposure to CpG motif in mouse skin. Immunology. 2003:110:341-347

7.   Th2 immunity to HBsAg primed by gene gun DNA vaccination can be shifted towards Th1 immunity by co-delivery of CpG motifs-containing ODN. Scandinavian Journal of Immunology. 2003, 58:350-357.

8.   CpG motif acts as a danger signal and provides a T helper type 1-biased microenvironment for DNA vaccination. Immunology. 2005 Jun;115(2):223-30.

9.   Vaccination with recombinant HBsAg-HBIG complex in healthy adults. Vaccine 2005; 23:2658-2664

10.  Effect of Plasmid DNA on Immunogenicity of HBsAg-Anti-HBs Complex.. Viral Immunology 1998 ; 11;65-72

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